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一般來說，實時PCR協議與標準PCR反應類似。在生產清潔模板、設計引物、優化反應條件等方面也有同樣的問題。主要的區別是加入插層劑，如SYBR綠色或使用熒光引物檢測PCR產物。在典型反應中，qPCR產物呈指數級生成。由于要使足夠的產品易于檢測，需要幾個周期，熒光圖與循環數圖顯示出乙狀結腸的外觀。在后期，反應底物逐漸枯竭，qPCR產物不再加倍，曲線開始平坦。熒光量開始迅速增加的曲線上的點，通常是基線上方的一些標準偏差。Ct與模板的曲線呈線性關系，因此，通過比較多個反應之間的Ct值，可以計算目標核酸的濃度。
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